Навигатор:   Здоровье!ЖенщинеГонорея у женщин → Лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика

Наиболее распространенными методами лабораторной диагностики гонореи являются: бактериоскопический, культуральный и серологический. Основным методом является бактериоскопический, с помощью которого в большинстве случаев можно распознать гонококк и правильно поставить диагноз. Главными признаками гонококка при бактериоскопической диагностике являются: форма диплококка, грамотрицательная окраска, внутриклеточное расположение. Эти признаки позволили в досульфамидный период почти безошибочно распознавать гонококк. Нередко эти признаки или часть из них могут отсутствовать. Раньше при распознавании возбудителя большое значение имело знание места взятия материала. Если материал для исследования был взят из мочеполовых путей, то лаборант считал, что имеет дело с гонококком, если из носоглотки или полости рта-то это чаще катаральный микрококк или менингококк. В настоящее время гонококк выделяют из полости рта у 2–5% больных, а менингококк — в 26–30%, причем клинических проявлений ни во рту, ни в половых органах при этом часто не обнаруживают. При лечении антибиотиками теряется форма диплококка (рис. 4), быстро исчезают внутриклеточные гонококки, изменяется отношение к окраске по Граму, гонококки дают пеструю картину: наряду с грамотрицательными появляются грамположительные или одна половинка грамположительная, а другая грамотрицательная и т.д. Появляются L-формы гонококков, и часто нельзя бактериоскопически распознать гонококк. В таких случаях необходимо прибегать к культуральному методу.

Рис. 4. Измененные шаровидные формы гонококка после приема пенициллина в малой дозе. Оптический микроскоп. × 90×4.

Гонококк хорошо красится всеми анилиновыми красителями, но дифференциально-диагностическое значение имеет только окраска по Граму, так как возбудитель обесцвечивается и красится в дополнительный цвет. К этому надо добавить, что и большинство других непатогенных грамотрицательных диплококков настолько похожи на гонококк (даже в неизмененном состоянии), что их трудно отличить и при электронно-микроскопическом  исследовании.

Большое значение имеет правильное взятие материала для исследования на гонококки и приготовление мазков, которые должны быть равномерно размазанными, не толстыми.

Неравномерно размазанные мазки невозможно хорошо окрасить по Граму. Гонококки в тонких слоях будут окрашены грамотрицательно или переобесцвечены, а в толстых — грамположительно. При исследовании этих мазков нельзя решить вопрос о таком важном дифференциальнодиагностическом признаке, как отношение гонококка к окраске по Граму.

Важное значение имеет также место и метод получения материала, особенно из шейки матки и прямой кишки. В свисающей части цервикального содержимого много посторонней флоры и мало гонококков, а в более глубоко расположенном материале в гнойных серовато-белых комочках, выделяющихся среди прозрачной слизи, обнаруживают много гонококков и меньше посторонней флоры. Для исследования берут гнойные комочки и равномерно размазывают их по стеклу. Из материала, взятого из каждого пораженного органа, готовят мазки на двух стеклах. Высушенные на воздухе мазки фиксируют на пламени и окрашивают один мазок 1% раствором метиленового синего, а второй по Граму. При окраске гонококка по Граму лучше пользоваться водным раствором кристаллического фиолетового и 1% водным раствором Нейтрального красного. Мазок, окрашенный метиленовым синим, используют только для предварительного просмотра. При наличии диплококков необходимо обязательно просматривать второй мазок, окрашенный по Граму, так как только такая окраска имеет дифференциальное значение. Следует быть очень осторожным при бактериоскопическом исследовании отделяемого у детей, у которых грамотрицательная флора может быть легко смешана с гонококком.

Высушенный и фиксированный на пламени мазок накрывают полоской фильтровальной бумаги размером немного меньше стекла и заливают 1% раствором кристаллического фиолетового на 1 мин. Затем бумагу снимают, мазок слегка смывают водой, заливают раствором Люголя на -1 мин в зависимости от толщины мазка, после чего раствор сливают и мазок обесцвечивают 96% этиловым спиртом. Обесцвечивание производят, погружая мазок в ванночку со спиртом и вынимая из нее, до тех пор, пока перестанут стекать струйки красителя и мазок будет бледно-серого цвета. Нельзя употреблять спирт более низкой концентрации, а также метиловый и пропиловый. Затем мазок быстро промывают водой и наливают 1% раствор нейтрального красного на 2 мин. Далее мазок опять промывают водой, высушивают и микроскопируют. Положительный ответ дают только на основании нахождения типичных гонококков. При сомнении только описывают полученные диплококки, в этом случае рекомендуется делать посев. Мазки, окрашенные метиленовым синим, в случае надобности, можно перекрасить по Граму. Для этого первый краситель снимают ксилолом, бензином или спиртом и далее окраску производят так же, как если бы мазок не был окрашен.

Для распознавания гонококков в отделяемом применяют также прямой иммунофлюоресцентный метод. Для этого тонкие мазки на предметных стеклах фиксируют на пламени, на препарат наливают меченую изотиоцианатом антигонококковую сыворотку и выдерживают в течение 35 мин во влажной камере, после чего мазки промывают в двух порциях фосфатного буфера (рН 7,3), подсушивают, наносят каплю забуференного глицерина и микроскопируют в люминесцентном микроскопе. Этот метод позволяет легко определить гонококк, но при этом происходит свечение представителей всего рода, Neisseria, и отдифференцировать их друг от друга трудно. Для этого применяют абсорбцию каждым из них, но она резко снижает свечение гонококков. Если фиксированный мазок с отделяемым предварительно окрасить 1% спиртовым раствором эозина и метиленового синего, а затем провести обработку флуоресцирующей сывороткой, то результаты получаются более демонстративными.

Deacon (1961) предложил для исследования выделений, особенно у женщин, так называемый замедленный метод. Сначала делают посев на питательные среды для гонококка, затем через 16–24 ч пребывания культуры в термостате готовят мазки и подвергают обработке обычным флюоресцентным методом. Этот метод, сочетая в себе элементы культурального и бактериоскопического, позволяет легче выявить гонококк в смешанных культурах, быстрее отдифференцировать гонококк от других микроорганизмов.

Культуральный метод имеет очень большое значение. К нему следует прибегать во всех случаях, когда подозревают гонорею, а бактериоскопически гонококки не находят. Методом посевов гонококки обнаруживают в 1 ½ -2 раза чаще, чем бактериоскопически, а некоторые авторы — даже в 4–6 раз чаше. При одновременном же применении бактериоскопического и культурального методов получают ещё больший процент выделения гонококков.

Для результатов этого исследования большое значение имеет своевременное и правильное взятие материала. Перед взятием материала для посева надо исключить применение больными антибиотиков в тот период, в течение которого предполагается наличие антибиотика и сульфамидного препарата в крови, нельзя использовать местные дезинфицирующие средства.

Материал из уретры берут для посева петлей, а из шейки матки — петлей или длинным пинцетом, предвари тельно протерев наружные отверстия стерильной ваткой. Первую порцию цервикальной слизи выбрасывают как содержащую большое количество посторонней флоры, а для посева выбирают слизисто-гнойные комочки из отделяемого внутренней части шейки матки. Посев производят или тем же длинным пинцетом, или петлей из нержавеющей стали Тампоны должны быть предварительно обработаны фосфаттным буфером и импрегнированы мелко истолченным древесным углем. Из бартолиниевых желез материал берут петлей, также предварительно протерев их поверхности ваткой.

Материал, взятый из каждого очага, засевают в две пробирки, или на чашки Петри путем размазывания по всей поверхности среды или, лучше, втирания. Часть материал целесообразно засевать на ограниченном участке, так как при небольшом количестве гонококков рост здесь получается лучше. Посев производят на свежие влажные среды Пробирки с засеянным материалом помещают в эксикатор с 10–20% содержанием углекислого газа и повышенной влажностью, полученной путем помещения в эксикатор пропитанной водой ватной прокладки. Эксикатор ставят в термостат с температурой 36,5–37°С, так как высокие температуры губительно действуют на гонококки, а низкие задерживают их рост. Гонококк очень требователен к питательным средам. Для его роста требуется добавление нативного белка, витаминов и соблюдения ряда условий.

Среда должна быть свежеприготовленной, влажной, не следует подвергать её длительной стерилизации, рН питательной среды 7,4–7,5 Наиболее простой и хорошей средой для выращивания гонококков является мясо-пептонный агар, лучше приготовленный из кроличьего мяса, плаценты или телятины с добавлением % асцитической жидкости, которую предварительно проверяют на содержание белка (в норме 1,5–3%), отсутствие желчи и дезинфицирующих веществ. Для консервирования асцитической жидкости добавляют хлороформ (1–1,54%), который удаляют путем трехкратного нагревания в течение /2 ч при температуре 55–56°С, после чего асцитическую жидкость можно добавлять к растопленному агару. Вместо асцитической жидкости можно применять жидкость гидроцеле, сыворотку, дефибринированную кровь. Удовлетворительный рост получают на среде Бейли (среда из бычьих сердец), на мясо-пептонном агаре с добавлением дефибринированной крови человека или кролика (среда Левинталя), на среде из плаценты.

В. Н. Беднова и М. В. Яцуха предложили безасцитные среды. Наиболее эффективные из них: 1) мясо-пептонный агар (рН 7,4–7,5) из кроличьего мяса (100 мл), обогащенный гидролизатом казеина (2 мл), дрожжевым аутолизатом (2 мл) и сывороткой крупного рогатого скота (20 мл); 2) такая же среда, но обогащенная вместо гидролизата казеина гемогидролизатом (2 мл). Все эти ингредиенты вырабатываются отечественной промышленностью.

Приготовление безасцитных сред сводится к тому, что все ингредиенты, взятые для обогащения, смешивают по прописи и добавляют к растопленному и остуженному до 55–56°С агару, хорошо перемешивают, разливают по 3–3,5 мл в пробирки и скашивают. В каждую пробирку добавляют по 0,5 мл мясо-пептонного бульона для увлажнения. Среду проверяют на стерильность, помещая в термостат на 24 ч. Каждая новая партия среды должна быть предварительно проверена параллельно со старой средой, дававшей хороший рост гонококков, путем посева культуры и материала от больных.

Материал с большим количеством посторонней флоры (особенно из прямой кишки) рекомендуется засевать на мясопептонный агар с добавлением антибиотиков: полимиксина М в концентрации 25 ЕД/мл и ристомицина сульфат в концентрации 20 ЕД/мл. Оба антибиотика подавляют рост грамположительных и грамотрицательных микробов, не влияя, как правило, на рост гонококка. При этом методе удается получить рост гонококка значительно чаще, чем на средах без антибиотиков, причем морфологические и тинкториальные свойства возбудителя не меняются.

В тех учреждениях, в которых нет собственной бактериологической лаборатории, можно пользоваться так называемыми транспортными средами, которые применимы для сохранения жизнеспособности гонококка. Наиболее распространенной транспортной средой является среда Стюарта.

Состав среды сохранения Стюарта в модификации Центрального кожно-венерологического института: 1) 1 л дистиллированной воды, свободной от хлора, 30 г агар-агара; 2) 900 мл дистиллированной воды, свободной от хлора, 2 мл тиогликолевой кислоты, 12 мл н. NaOH, 100 мл 20% водного раствора натриевой соли однозамещенного фосфата, 20 мл 1% раствора хлорида кальция. Смесь № 2 прибавляют к свежерасплавленному агару (смесь № 1). Проверяют рН и, если нужно, доводят его до 7,3–7,4. Среду разливают в стерильные пробирки по 10 мл в каждую и стерилизуют текучим паром в течение 1 ч.

Для посева на среду сохранения материал забирают тампоном, предварительно обработанным фосфатобуферным раствором, и импрегнируют тонко измельченным древесным углем. После взятия материала тампон погружают возможно глубже в среду сохранения, после чего пробирку закрывают резиновой соской. Пробирки с засеянным материалом помешают в холодильник с температурой 1–4° С. В возможно более короткие сроки засеянные пробирки отправляют в те лаборатории, где делают посев на среды, наиболее благоприятные для получения роста гонококка. Чем быстрее доставляют материал для посева в лабораторию, тем больше процент высева гонококка. При пересевах материала через 24–30 ч мы получили рост гонококка в 88–98%, при пересевах через 24–48 ч — в 84,6–85,2% случаев.

Гонококк на искусственных питательных средах обычно вырастает через 24 ч, при пересевах с транспортных сред и при посевах материала от женщин с хронической гонореей рост возбудителя наступает позднее. Практически следует наблюдать за ростом в течение 5–7 дней. Через 24 ч образуются прозрачные бесцветные или бледно-желтоватой окраски мелкие колонии, имеющие вид росы. Края колонийи ровные, гладкие, поверхность блестящая, ровная, возвышается над средой наподобие срезанного шара. Через 48–72 ч. колонии увеличиваются в размерах, темнеют, центр становится желтовато-коричневым. Затем колония уплощается. Иногда на поверхности колонии гонококка образуется валик или многочисленные узелковые разрастания — дочерние колонии.

Выросшую колонию идентифицируют по внешнему вид и на основании результатов последующего микроскопического исследования мазков из нее, окрашенных по Граму Гонококк из культуры, выросшей через 24 ч, обычно имеет форму диплококка или грамотрицательных кокков одинако вой величины. Через 72–96 ч культура становится поли морфной и по Граму окрашивается неравномерно.

Помимо гонококка, в мочеполовых путях могут встречаться и другие грамотрицательные микробы, чаще менингококк и катаральный микрококк (по новой классифи кации N. catarralis), а при исследовании содержимое носоглотки и полости рта можно обнаружить почти всех представителей рода Neisseria. Все микробы отличаются по ферментации углеводов. При посевах материала из мочеполовых путей на гонококки практически можно обойтись тремя углеводами — глюкозой, мальтозой и левулезой. Гонококк разлагает только глюкозу, менингококк — глюкозу и мальтозу, N. catarralis не разлагает ни одного сахара. Измененные формы (атипичные), а также старые штаммы этих микробов могут не разлагать ни одного углевода или ферментировать дополнительно другой углевод. Таким образом, ферментация углеводов может быть убедительна только для типичных гонококков. Следует также помнить, что катаральный микрококк удовлетворительно растет на простом агаре при комнатной температуре в противоположность гонококку и менингококку.

Хорошей средой ферментации является среда, предложенная Т. Tuhlin (1963), которую Т. Г. Коликова и соавт. (1978) модифицировали, приготовляя следующим образом. Скорлупу куриного яйца обрабатывают спиртом и вскрывают пинцетом, отделяют желток и переносят его в колбу. Градуированной пипеткой берут 15 мл желтка и помещают в другую колбу, в которую вносят раствор 1,5 г сахара, 6 мл раствора фенола красного и 100 мл мясо-пептонного агара из кроличьего мяса (рн 7,4), предварительно растопленного на водяной бане и охлажденного до 56°С. Все манипуляции проводят с соблюдением стерильности. В процессе добавления ингредиентов среду хорошо перемешивают и разливают по 20 мл в чашки Петри. Среду хранят в холодильнике при 4°С не более 2 нед. Для определения ферментативных свойств среду засевают суточной культурой и чашки помещают в эксикатор, не содержащий углекислого газа. Присутствие углекислого газа делает невозможным определение разложения Сахаров. При определении ферментации других неиссерий и N. catarralis чашки помещают в термостат без эксикатора. Авторы рекомендуют учет ферментативных свойств проводить через сутки после посева на среду ферментации. При посеве на эту среду сохраняются морфологические свойства гонококка.

Приготовление сахара: 1,5 г каждого сахара разводят в 1 мл дистиллированной воды и стерилизуют кипячением на водяной бане в течение 15 мин. Раствор фенолового красного готовят разведением 4 г фенолового красного в 100 мл 1 я. раствора NaOM при постоянном помешивании при температуре 37° С, доливают дистиллированной водой до 2 л, доводят рН до 7,8, используя 5 н. раствор хлористоводородной кислоты, и стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 20 мин.

В качестве вспомогательного теста для дифференцировки гонококка можно использовать реакцию агглютинации. В случаях роста в культуре обильной посторонней флоры может оказать пользу оксидазная реакция. Для её выполнения применяют диметилпарафениленамин или другие производные фениленаминов. При отсутствии чистых реактивов пользуются цветными проявителями Т-2, Т-3, Т-34, содержащими производные фениленаминов.

Для постановки оксидазной реакции применяют 1% водные растворы, приготовленные непосредственно перед проведением реакции. При стоянии они быстро окисляются и становятся непригодными. Пастеровской пипеткой наливают реактив на поверхность колоний. Через несколько секунд оксидазоположительные колонии окрашиваются в розовый цвет, переходящий в течение последующих 10–15 мин в красный и черный. Окрашенные колонии снимают петлей, делают мазки на предметном стекле и окрашивают по Граму. При микроскопическом исследовании гонококки сохраняют свои грамотрицательные свойства.

Окрашенные колонии могут быть пересеяны на свежую питательную среду, но делать это надо как можно быстрее, так как реактивы действуют на гонококки токсическим образом. Гонококки в пересевах сохраняют все свои морфологические и тинкториальные свойства. Оксидазная реакция не обладает специфичностью. Все представители рода Neisseria, а также ряд других микроорганизмов могут давать реакцию на оксидазу, но метод позволяет легче выявлять гонококковые колонии среди других колоний, дающих реакции на оксидазу.

Кроме метода посева, для диагностики гонореи пользуются серологическим исследованием крови по реакции Борде — Жангу. В качестве антигена в настоящее время применяют антиген, приготовленный путем озвучивания культур гонококка. Результаты в значительной степени зависят от качества антигена. Имеются данные, что антигены гонококка, приготовленные из пилей гонококка, дают лучшие результаты, чем другие антигены. Следует отметить, что реакция Борде — Жангу становится положительной не раньше чем через 3–4 нед от начала заболевания, т.е. в то время, когда при современных методах лечения гонорею уже излечивают. Вследствие этого реакция Борде — Жангу в настоящее время при свежей гонорее не имеет значения.

При хронической или осложненной гонорее, при дифференциальной диагностике воспалений матки, придатков и суставов реакция может принести существенную пользу. Она может оставаться положительной у лиц, давно закончивших лечение. Следовательно, реакция Борде — Жангу не может быть использована в качестве критерия излеченности. Таким образом положительная реакция Борде — Жангу не может быть бесспорным доказательством излечения гонореи, так же как и отрицательные результаты не могут быть стопроцентной гарантией её отсутствия. Чаще, однако, длительно получаемые положительные результаты реакции указывают на наличие гонореи. Реакция Борде — Жангу может становиться положительной у лиц, получивших гонококковую вакцину, ранее болевших гонореей и излечившихся. Такие реакции носят название следовых. Реакция Борде — Жангу может давать неспецифические результаты у лиц, страдающих другими заболеваниями, например, у больных сифилисом, а также у беременных. Методика проведения реакции существенно не отличается от постановки реакции Вассермана, поэтому для её выполнения следует пользоваться инструкцией для постановки реакции Вассермана.

← Современные представления об ультраструктуре гононоккаИммунитет при гонорее →